一、 實驗儀器與試劑
表格一：實驗儀器
儀器名稱 | 型號 | 生產(chǎn)廠家 |
低溫高速離心機 | 64R | BECKMAN |
PCR 儀 | 9700 | ABI |
熒光定量 PCR 儀 | 7500 | ABI |
儀器 | 廠家 | 型號 |
小型垂直電泳槽 | Biorad | 164-8001 |
轉(zhuǎn)印槽 | Biorad | Trans-Blot |
脫色搖床 | 常州澳華 | TY-80B |
電泳儀 | 上海天能 | EPS-200 |
低溫高速離心機 | 64R | BECKMAN |
酶標儀 | Thermo | Thermo Scientific Microplate Reader |
表格二：試劑
試劑名稱 | 廠家 |
PBS (0.01M, pH 7.4) | 自配 |
Trizol | Life Technologies |
Lv仿 | 國藥集團 |
異丙醇 | 國藥集團 |
乙醇 | 國藥集團 |
PrimeScript® RT reagent Kit | Takara |
熒光定量試劑盒 | Takara |
二、 實驗步驟
1、樣本處理
4℃ 12000rpm 離心收集細胞，棄上清。PBS 清洗 1 遍后，加入 1mL Trizol 充分混勻。
2、兩相分離 每個樣品中加入 0.2 mL 的lv仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩管體，室溫靜置 5min。4℃下 12000rpm
離心 15 min。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lv仿相，中間層和上層的無色的水相。RNA 全部被分配于水相中。水相的體積大約是勻漿時加入的 Trizol 試劑的 60%。
3、RNA 沉淀 將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。加入等體積的異丙醇，水相與異丙醇混合以沉淀其中的 RNA?；靹虿⒃谑覝胤跤?10 min 后，4℃ 12000rpm 離心 10 min。
4、RNA 清洗 移去上清液，加入 1 mL 75%乙醇，清洗 RNA 沉淀。振蕩后，4℃ 7500 rpm 離心5 min。
5、重新溶解 RNA 沉淀
去除乙醇溶液，空氣中干燥 RNA 沉淀 5-10 min。溶解 RNA 時，先加入無 RNA 酶的水用槍反
復(fù)吹打幾次，然后 55 到 60℃孵育 10 min。獲得的 RNA 溶液保存于- 70℃。
6、反轉(zhuǎn)錄
1) 按下列組份配制 RT 反應(yīng)液
5×PrimeScript Buffer | 5 μL |
PrimeScript® RT Enzyme Mix I | 1 μL |
Oligo dT Primer(50 μM)×1 | 1 μL |
Random 6 mers(100 μM)×1 | 1.5 μL |
Total RNA | 1 ng |
RNase Free ddH2O | Up to 25 μL |
2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15min，85℃ 5s。
3）反應(yīng)結(jié)束后，將其放在冰上待用或-20℃保存。
7、熒光定量 PCR
引物設(shè)計
Gene | Forward Primer | Reverse Primer |
β-action | 5′-TTCCAGCCCTCCTTCCTG-3′ | 5′-GCCCGACTCGTCATACTCC-3′ |
BCL | 5′ -CTACCGTCGTGACTTCGC -3 | 3′-CCTATTGCCTCCGACCCT-5′ |
按下列組份配制 Realtime PCR 反應(yīng)體系
SYBR Premix Ex Taq | 10 μL |
PCR Forward Primer(10μM) | 1 μL |
PCR Reverse Primer(10μM) | 1 μL |
cDNA 模板 | 1 μL |
ddH2O | 7 μL |
Total | Up to 20 μL |
用漩渦振蕩器將管中溶液*混合均勻，短暫低速離心。
3）點樣。將混合好的液體加入孔板中，每個樣本的每個基因保證3個復(fù)孔,點完樣之后將 PCR 板置于離心機中 2000rpm、2min，然后用錫箔紙將板包好，置于 4 度冰箱中備用。 4） PCR 反應(yīng)
Real time PCR 儀使用 ABI7500,PCR 程序已優(yōu)化 將步驟 3 中已點好樣的 PCR 板置于 Realtime PCR 儀上進行 PCR 反應(yīng)：首先是預(yù)變形：95℃/10min
第二步是循環(huán)反應(yīng) 40 cycles : 95℃/15s; 60℃/45s(收集熒光) ;72℃/45s 第三步溶解曲線：95℃/15s; 60℃/1min ;95℃/15s
三、 結(jié)果與計算（采用 2 - △△ CT 法進行分析）
基因相對表達量
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