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描述

無(wú)論是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模樣品制備、還是生產(chǎn)規(guī)模工藝過(guò)程，去除核酸都可以改善工藝流程，如蛋白純化、病毒載體制備、mNGS中樣品處理等過(guò)程。而核酸酶的選擇，就顯得特別重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶，HL-SAN) 是一種非特異性內(nèi)切酶，在高鹽濃度下具有較佳活性；且該酶在多種緩沖液中都有活性，很容易通過(guò)還原劑處理而失活。這些特性使HL-SAN在需要去除DNA和RNA的應(yīng)用中，更為適合。

核酸污染，特別是宿主基因組DNA污染，在幾乎所有工藝流程及生物制品的生產(chǎn)中，都是需要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。一方面，宿主DNA的存在，影響目標(biāo)產(chǎn)物的純化及下游質(zhì)量分析等。另一方面，宿主DNA殘留能引起機(jī)體嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，是生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)之一，FDA及NMPA等對(duì)Host Cell DNA (HCD)有嚴(yán)格的質(zhì)控要求。

宿主基因組DNA中，組蛋白與DNA形成核小體，核小體緊密折疊形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的染色質(zhì)。組蛋白與DNA間存在強(qiáng)烈的離子作用及疏水作用，再加上特殊的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致宿主DNA很難被準(zhǔn)確檢測(cè)并清除。已有文獻(xiàn)表明，高鹽濃度下組蛋白與DNA解離相對(duì)*，這有利于宿主DNA的檢測(cè)及去除。但市售的絕大多數(shù)核酸酶在高鹽濃度下活性很弱，甚至*失活。而耐高鹽的HL-SAN成了這類應(yīng)用的理想選擇。

高鹽濃度能夠提高去除效率

HL-SAN是一種新型的、耐高鹽的工程化內(nèi)切酶。該酶在0.5 M NaCl條件下具有較佳活性，是去除宿主DNA污染的理想選擇。

鹽濃度是去除過(guò)程的重要參數(shù)之一。高鹽濃度下，宿主DNA與蛋白質(zhì)能夠*解離，從而更容易被降解。

推薦應(yīng)用

• 病原微生物診斷應(yīng)用，如宏基因組測(cè)序（mNGS）樣品去除宿主DNA；
• 蛋白純化，特別是DNA結(jié)合蛋白；
• 病毒載體制備，如腺相關(guān)病毒（AAV）、腺病毒（AdV）等；
• 其他需要去除宿主DNA的應(yīng)用等。

優(yōu)勢(shì)

• 高鹽條件下，DNA清除效率更高，宿主DNA殘留更少；
• pI為9.6，容易跟絕大多數(shù)蛋白分離；
• 還原劑存在時(shí)，酶易失活，減少對(duì)后續(xù)流程的影響。

使用指導(dǎo)

• DNA去除方案

從細(xì)胞抽提物或細(xì)胞裂解液中去除DNA污染，HL-SAN的使用量受到多種因素影響，如細(xì)胞類型、裂解液組成、NaCl濃度、Mg²⁺濃度、裂解液pH等。參考方案見Figure 1。比如，對(duì)于1ml細(xì)胞裂解樣品，調(diào)整到0.3-0.75 M NaCl濃度，加入1000 U HL-SAN，15℃-37℃溫度條件下孵育30-60min，或者4℃過(guò)夜。Mg²⁺是必須的。

Figure 1. 不同樣品、不同去除要求下，HL-SAN的推薦濃度及反應(yīng)條件。（DNA removal的要求是指通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳看不到條帶。Decontamination的去除要求是對(duì)23S rDNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)為陰性。）

• 滅活

滅活是通過(guò)添加還原劑（TCEP或DTT）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，推薦用TCEP（因?yàn)?/font>TCEP在磷酸鹽溶液中不穩(wěn)定，特別在中性pH下）。不同工藝流程中，通過(guò)改變孵育時(shí)間、溫度和還原劑的濃度等來(lái)滅活該酶。一般情況下， 25-37℃反應(yīng)5-10分鐘，可以滅活99%以上的酶。為了避免酶恢復(fù)活性、再次激活，保持低濃度還原劑，如0.1-0.5 mM DTT或TCEP，或延長(zhǎng)滅活反應(yīng)時(shí)間。

Figure 2. HL-SAN的滅活反應(yīng)條件。

• 去除

HL-SAN的pI是9.6，能夠緊密結(jié)合陽(yáng)離子交換柱。在pH 9.0條件下用0.2M鹽沖洗，柱子的流出液/廢液中只有不到0.02%酶脫落。需要注意的是，不推薦使用陰離子交換柱去除HL-SAN，因?yàn)?/font>HL-SAN的糖基化修飾會(huì)結(jié)合到柱子上。

Figure 3. HL-SAN緊密結(jié)合在SP-sepharose柱子上（體系是0.2 M鹽濃度，pH 9.0）。

應(yīng)用實(shí)例：

高效去除人體DNA (99.99%)干擾、快速檢測(cè)下呼吸道感染（LRIs）病原

呼吸道感染（RIs）病原的快速檢測(cè)一直是醫(yī)療中亟待解決的問(wèn)題。RIs樣本類型眾多并且病原含量差別很大，同時(shí)帶有大量的人體細(xì)胞，因此搭建一套快速、高效的樣本處理系統(tǒng)對(duì)于通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行病原檢測(cè)至關(guān)重要。

2019年Nature Biotechnology文章報(bào)道了如下流程。為了盡可能去除宿主DNA、提高檢測(cè)靈敏度，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的人體宿主細(xì)胞去除、微生物DNA提取和nanopore測(cè)序等三個(gè)步驟都做了對(duì)應(yīng)的優(yōu)化，比如宿主DNA去除時(shí)找到了合適濃度的saponin（2.2%），HL-SAN步驟由兩步減為一步，清洗步驟縮減為2次。從拿到樣本到建庫(kù)完成縮短至6hr，且在終檢測(cè)中達(dá)到了96.6%的敏感性和100%的特異性。

Figure 4. Nanopore宏基因組快檢流程。

酶學(xué)特征

來(lái)源：Pichia pastoris

酶比活：≥1.75 x 10^5 Units/mg

酶活定義：在37℃，25mM Tris-HCl，pH8.5 (25℃)，5mM MgCl2，500mM NaCl反應(yīng)體系中，一個(gè)單位的HL-SAN在30分鐘內(nèi)消化50 µg/ml的小牛胸腺DNA（Sigma， D-1501），產(chǎn)生OD260nm處1A的吸光值變化。

特異性：非特異性內(nèi)切核酸酶，能夠?qū)捂溂半p鏈的DNA及RNA，消化成5個(gè)堿基為主的寡核苷酸oligos。

酶活條件：（Effective是指活性在較優(yōu)活性10%以上的條件范圍）

References

Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection.

Charalampous T, Kay GL, Richardson H, Aydin A, Baldan R., Jeanes C, Rae D, Grundy S, Turner DJ, Wain J, Leggett RM, Livermore DM, O’Grady J. Nature Biotechnology. 2019; 37: 783–792.

A Structured Workflow for Mapping Human Sin3 Histone Deacetylase Complex Interactions Using Halo-MudPIT Affinity-Purification Mass Spectrometry. Banks CAS, Thornton JL, Eubanks CG, Adams MK, Miah S, Boanca G, Liu X, Katt M, Parmely T, Florens LA, Washburn MP. Molecular & Cellular Proteomics. 2018; 17 (7): 1432-1447.

Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida. Williamson A, Pedersen H. Protein Expr Purif. 2014; 97: 29-36.

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Cutting-edge enzymes from Norway 來(lái)自挪威的酶類

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